Sonder les modes de liaison des inhibiteurs de petites molécules à le domaine Polo-Box de la kinase de type Polo Polo 1

polo-like kinase 1 (Plk1) appartient à une sous-famille de Ser / Thr protéines kinases, collectivement appelées polo-like kinases (Plks). Un nombre croissant de preuves suggère que Plk1 joue un rôle pivot au cours des multiples étapes de la progression de la phase M et, par conséquent, dans la prolifération cellulaire.1 Sans surprise, Plk1 est surexprimé dans un large spectre de cancers chez les humains2. a révélé que Plk1 est indispensable pour la viabilité des cellules cancéreuses activées par délétion de Ras ou de p53.3,4 Ainsi, Plk1 est une cible attrayante pour le développement de thérapeutiques anticancéreuses. Plk1 offre, au sein d’une molécule, deux cibles médicamenteuses fonctionnellement différentes avec des propriétés distinctes: le domaine catalytique N-terminal (NCD) constitué de 250 résidus d’acides aminés et le domaine polo-boîte non catalytique, mais fonctionnellement essentiel, C-terminal. (PBD) composé de deux motifs de polo-boîte (PB1 et PB2) avec 80 résidus dans chaque motif. Au cours des années, les efforts pour générer des inhibiteurs spécifiques de Plk1 en ciblant l’activité catalytique de Plk1 ont rencontré des difficultés importantes, principalement en raison du degré élevé de similitudes structurelles entre les poches de liaison à l’ATP de la superfamille des protéines kinases. Par conséquent, le développement de nouveaux inhibiteurs qui ciblent la PBD structurellement unique de Plk1 peut servir de stratégie alternative.5 À ce jour, au moins sept structures cristallines aux rayons X de la PBD humaine Plk1 ont été résolues et signalées par plusieurs groupes. .8 − 11 Les résultats montrent que les PB1 et PB2 contiennent des plis identiques de β 6 α (une feuille antiparallèle à six brins β et une hélice α) et forment un module de liaison de phosphopeptide hétérodimère. Divers phosphopeptides, y compris PLHSpT (composé 1; Figure 1) 1) du motif T78 d’une protéine centromère PBIP1,12 se lient au PBD dans une fente formée entre les motifs PB1 et PB2 en formant directement et des liaisons hydrogène pontées (figure ​ (figure 1) .1). Les résidus His 538 et Lys 540 du PB2 sont essentiels pour les interactions électrostatiques avec le groupe phosphate négativement chargé du résidu Thr (pThr) phosphorylé, tandis que le résidu Trp 414 du PB1 est central pour la sélection du résidu Ser au niveau du pThr. -1 position (− 1 indique la position relative du résidu Ser du résidu pThr) en s’engageant dans la liaison hydrogène et les interactions de van der Waals.8,9Figure 1Le mode de liaison de PLHSpT avec le PBD Plk1. les phosphopeptides de liaison, seuls trois composés, la purpurogalline (PPG, composé 2), la poloxine (composé 3) et la thymoquinone (composé 4), ont été rapportés sous la forme de petits inhibiteurs de la PBD de type Plk1. PPG, identifié à partir d’un criblage à haut débit in vitro conçu pour isoler les inhibiteurs potentiels anti-PBD, est un composé naturel contenant du benzotropolone dérivé de nutgall.6 PPG délocalise Plk1 de structures subcellulaires spécifiques et induit un arrêt mitotique dépendant du point de contrôle dans HeLa cellules, 6 qui serait attendu si elle perturbe la fonction de PBD in vivo. Il est intéressant de noter que les composés de type PPG dépourvus du groupe 4-hydroxyle (voir la Figure 22 pour la numérotation des atomes) n’inhibent pas la PBD de Plk1, suggérant que ce groupe est nécessaire pour l’activité inhibitrice observée.6 De même, poloxine et thymoquinone, isolées à partir d’un autre criblage à haut débit d’inhibiteurs de la PBD, ont été rapportées comme inhibant la fonction de Plk1 PBD in vitro et interférant avec la fonction de Plk1 PBD in vivo.7Figure 2Structures of compounds 1 − 4.Pour déterminer quantitativement l’efficacité de L’inhibition de la liaison à la PBD par ces composés, un test d’inhibition basé sur l’enzyme ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) qui utilise l’interaction spécifique entre la PBD Plk1 et un ligand du motif p-T78 de PBIP112 a été réalisée. ). L’addition du peptide PLHSpT a provoqué une inhibition de la PBD de Plk1 dépendante de la dose (Figure 3) avec un Kd de 0,445 μ M.11 Dans les mêmes conditions, PPG présentait un niveau modéré d’inhibition de la PBD. avec un Kd estimé de 2,7 μ M (basé sur l’observation que l’activité inhibitrice de PPG est ∼ 6 fois plus faible que celle de PLHSpT sur la figure ​ Figure3) .3).De manière surprenante, cependant, la poloxine n’a pas montré de niveau significatif d’inhibition de la PBD même à une concentration 1000 fois supérieure à celle du ligand p-T78. Les activités relatives des composés 1 dans l’inhibition de la PBD de Plk1 sont résumées dans le tableau 1. Comme le test est spécifique de la présence d’une interaction PBD phospho-dépendante, ces résultats suggèrent que, contrairement au PPG, la poloxine peut ne pas se lier directement au module de phospho-reconnaissance de la PBD Plk1 cialisprix.net. Figure 3Inhibition de la liaison de Plk1 PBD par PLHSpT, PLHST, PPG et poloxine. Une meilleure compréhension du mode de liaison de la PPG à la PBD pourrait permettre de mieux comprendre la conception et le développement de puissants inhibiteurs de petites molécules contre le PBD. Les méthodes d’ancrage virtuel traditionnelles supposent qu’un récepteur est rigide. Cependant, cette hypothèse conduit souvent à des résultats trompeurs et à des conclusions erronées car, en réalité, de nombreuses protéines subissent des mouvements de chaîne latérale ou de squelette ou les deux lors de la liaison au ligand. Bien que la structure globale de la PBD semble être en grande partie la même en présence ou en l’absence d’un peptide de liaison 11, les mouvements de charnière des deux motifs de polo-boîte les uns par rapport aux autres suggèrent que le site de liaison PBD est quelque peu flexible. Conformément à cette vue, un alignement étroit des structures cristallines de 3HIK11 (complexé avec PLHSpT) et 1Q4O8 (aucun ligand) a révélé que certaines chaînes latérales se déplacent clairement en réponse à la liaison phosphopeptide (voir la figure S1 de l’information de support). Ainsi, Schr ö Induced Fitting Docking (IFD) protocole 13 du dinger a été utilisé pour explorer les modes de liaison de PPG à la PBD. Parce que PPG a un groupe hydroxyle énolisé et trois groupes hydroxyle phénoliques, il faut aborder l’état de protonation des quatre groupes hydroxyles dans des conditions physiologiques. A cette fin, ADME Boxes 4.914 et Marvin 5.1.4.15 ont été utilisés pour calculer les valeurs de pKa de chaque groupe hydroxyle. Les deux méthodes ont donné des valeurs de pKa similaires (tableau 2): les groupes hydroxyle 1 et 4 avaient des valeurs pKa calculées de ∼ 6,0 et ∼ 8,0, respectivement, alors que les deux autres groupes hydroxyle avaient des valeurs plus élevées. Ces résultats suggèrent qu’à pH 7,4, le groupe hydroxyle 1 est susceptible d’être déprotoné; le groupe hydroxyle 4 pourrait être déprotoné, tandis que les deux autres pourraient ne pas l’être. La figure 44 montre la distribution microspécifique de la PPG calculée par Marvin 5.1.4: à pH 7,4, 76,5, 15,0 et 3,0% du PPG seraient présents en tant que microspécies 2-2, 2-3 et 2- Figure 4: Distribution des micro-espèces de PPG calculée par Marvin 5.1.4.Tableau 2 Valeurs pKa calculées pour les groupes hydroxyle dans PPGLes microspécies majeures prédites aux conditions physiologiques, 2-2, qui a une charge négative, ont été ancrées dans le site actif de la PBD lorsqu’il est examiné par IFD. L’une des conformations ancrées présentant un IFDScore de 8,47 kcal / mol est représentée sur la figure 5,5, ce qui démontre que PPG peut remplir la poche SpT du puits PBD en utilisant presque chaque partie de la molécule. . Le groupe hydroxyle énolisé négativement chargé de la PPG liée forme une interaction électrostatique avec His 538 chargé positivement; les trois autres groupes hydroxyle phénoliques et le groupe carbonyle forment quatre liaisons hydrogène avec le Lys 540 chargé positivement, le squelette NH de Trp 414, le cycle indole de Trp 414 et le squelette carbonyle de Leu 491; le cycle phényle et une double liaison dans le cycle tropolone de la forme PPG π − π interactions d’empilement avec le cycle pyrrole et le noyau phényle (tous deux noyés dans le cycle indole) de Trp 414, respectivement. Nous émettons l’hypothèse que les microspécies 2-3 auraient des interactions similaires avec une plus grande affinité, car le groupe hydroxyle 4 serait chargé négativement; ainsi, la liaison hydrogène formée entre ce groupe et le squelette NH de Trp 414 serait beaucoup plus forte que celle formée entre le groupe hydroxyle non déprotonné 4 et le squelette NH de Trp 414. Nos résultats IFD supplémentaires supportent cette hypothèse avec un meilleur IFDScore de − 9,24 kcal / mol. L’analogue de PPG dépourvu du groupe hydroxyle 4 a également été utilisé dans l’étude d’amarrage. Cependant, il n’a pas formé de poses d’amarrage raisonnables. En accord avec les observations faites par Watanabe et al. 6, cette découverte suggère fortement que le groupe hydroxyle 4 est critique pour l’inhibition de la PBD.Figure 5Proposé mode de liaison de PPG à la Plk1 PBD généré par le protocole IFD de Dinger (voir le texte pour les détails). Dans une étude précédente, nous avons montré que PLHSpT et LHSpT montrent des niveaux élevés et modérés de liaison à la PBD, respectivement, tandis que HSpT et SpT ne parviennent pas à afficher un niveau d’affinité détectable.11 Ces observations suggèrent l’importance des résidus N-terminaux pour la stabilité de l’interaction entre les phosphopeptides et le PBD.Cependant, contrairement à PPG, PLHSpT n’a pas réussi à afficher π − π interaction d’empilement avec le résidu Trp 414 (tableau 3). De plus, l’indispensabilité du groupe hydroxyle 4 dans PPG pour la liaison de PBD suggère également que la liaison hydrogène entre ce groupe et le squelette NH de Trp 414 est critique pour l’interaction. Ces résultats suggèrent que l’exploitation des interactions avec Trp 414 est probablement importante pour atteindre une liaison de haute affinité de petites molécules de type médicamenteux à la PBD.Tableaux 3D dans la liaison PBD entre PLHSpT et PPGPoloxine échoués à ancrer dans la poche de phospho-liaison de la PBD utilisant IFD, peu importe si une liaison hydrogène à l’un des résidus His 538 et Lys 540 cruciaux pour la liaison phospho-dépendante de PBD a été fixée comme contrainte. Cette découverte suggère que la poche SpT de PBD n’est pas la cible directe de la poloxine. Cette vue est en bon accord avec les résultats obtenus avec l’essai d’inhibition de liaison à la PBD montré sur la figure 33. Ensuite, comment la poloxine peut-elle inhiber la PBD de Plk1 et interférer avec la fonction de Plkl? Il a été montré que l’inhibition de l’activité kinase de Plk1 délocalise aussi Plk1 en altérant la localisation subcellulaire dépendante de PBD par un mécanisme d’auto-amorçage et de liaison.17,18 Nous avons donc examiné si la poloxine influence ou non l’activité kinase de Plk1 en portant des tests de kinase Plk1 in vitro. Cependant, dans les conditions où un inhibiteur de Plk1 NCD, BI 253617 (voir figure S2 de l’information de support), inhibait puissamment Plk1, la PPG et la poloxine ne présentaient aucun niveau détectable d’activité inhibitrice contre Plk1 (voir la figure S3 de l’information de support). Nous avons ensuite examiné deux autres mécanismes possibles pour l’activité inhibitrice de la poloxine contre Plk1 PBD: (1) La poloxine peut se lier à un autre site crucial dans la PBD, et / ou (2) elle peut former une liaison covalente avec l’un des acides aminés nucléophiles des chaînes latérales des résidus Cys, Lys, Ser ou His de la PBD par l’intermédiaire de son groupe carbonyle hautement réactif α, β médicaments pour le traitement du cancer.20 Le programme SiteMap 2.321 a été utilisé pour localiser d’autres sites actifs possibles de PBD. En plus du site qui contient le phosphopeptide, deux poches supplémentaires (poches n ° 1 et n ° 2) ont été trouvées (tableau 4). Il est intéressant de noter qu’un résidu Cys fortement nucléophile (Cys 544 dans la poche # 1 et Cys 573 dans la poche # 2, voir le tableau 4 pour plus de détails) est situé sur le bord de chacune de ces poches. Cette découverte nous a conduit à spéculer que les accepteurs de Michael tels que la poloxine et la thymoquinone pourraient subir des modifications covalentes avec le résidu Cys de la PBD Plk1 et ensuite remplir la poche pour inhiber cette dernière. En accord avec cette observation, la poche n ° 1 est une fente profonde (Figure 6A) (Figure 6A) suffisante pour permettre à la poloxine ou à la thymoquinone d’être ancrée facilement dans la poche par IFD. En revanche, la poche # 2 est peu profonde et est composée de résidus chargés et polaires; en conséquence, il peut être incapable de loger les molécules hydrophobes globales telles que la poloxine et la thymoquinone pour remplir cette poche. Figure 6: Liaison de la nature de la poloxine et de la thymoquinone à la PBD de Plk1. (A) Pocket # 1 identifié par SiteMap 2.3. (B) Mécanismes proposés d’inhibition de la PBD par la poloxine et la thymoquinone. (C et D) Modes de liaison proposés de la poloxine (C) et de la thymoquinone (D) .Tableau 4Deux nouvelles poches de PBD Plk1 prédites par SiteMap 2.3Pour explorer plus avant la nature contraignante de la poloxine et de la thymoquinone dans la poche n ° 1, nous les connectons manuellement de ces composés au groupe thiol de Cys 544 sur le bord de la poche. La réaction nucléophile entre le résidu Cys 544 et la poloxine ou la thymoquinone peut se produire de plusieurs manières différentes. Nous proposons qu’une réaction avec la chaîne latérale de la cystéine nucléophile pourrait se produire au niveau de l’atome de carbone sp2 le moins encombré stériquement, donnant les adduits covalents montrés dans la figure 6B.6B. Les complexes ont été minimisés en solution aqueuse en utilisant MacroModel 9.7.22 Ces analyses ont suggéré que la poloxine et la thymoquinone interagissent avec PBD en formant une liaison hydrogène avec Arg 500 et des interactions hydrophobes avec Pro 545 et Leu 546 (Figure 6C, D) .6C, D). En outre, le cycle benzylique de la poloxine pourrait être pris en sandwich entre les chaînes carbonées de Asn 527 et Arg 507. Le mécanisme impliquant la formation de liaisons covalentes entre la poloxine et la PBD est compatible avec l’inhibition dépendant du temps observée par Reindle et al.7Sur la base des résultats obtenus à partir de l’essai d’inhibition de liaison à la PBD et de l’IFD, nous proposons donc que la poloxine inhibe la Plk1 PBD par un mécanisme qui se distingue de la liaison à la poche SpT de la PBD.Cette vue peut aider à expliquer pourquoi la poloxine, qui n’a pas présenté d’activité d’inhibition de Plk1 PBD dans notre test de compétition basé sur ELISA (Figure 3), inhibe la PBD Plk1 dans un test de liaison in vitro différent et induit Plk1. D’autre part, PPG peut facilement remplir la poche SpT du PBD en engageant un π − π interaction avec l’anneau indole de Trp 414, une interaction électrostatique avec His 538, et quatre liaisons hydrogène avec Lys 540, Trp 414 et Leu 491. Ce π − π interaction, qui n’a pas été observée dans les interactions entre les phosphopeptides et le PBD, pourrait être important pour la liaison efficace de petites molécules de type médicament à la PBD.Dans cette étude, nous avons proposé un modèle de liaison pour PPG, un petit médicament molécule qui inhibe la PBD de Plk1. Notre modèle postule plusieurs interactions cruciales avec le PBD. En plus des interactions avec les résidus His 538 et Lys 540 chargés positivement dans le motif PB2 (de préférence de nature électrostatique), plusieurs interactions distinctes avec le Trp 414 dans le motif PB1 semblent être critiques. Ceux-ci incluent π − π les interactions avec le cycle indole de Trp 414, une interaction de liaison hydrogène avec son squelette NH, et une autre interaction de liaison hydrogène directe ou pontée avec son cycle pyrrole NH. L’importance des résidus His 538, Lys 540 et Trp 414 dans la liaison à la PBD est corroborée par des études cellulaires où des mutations dans ces résidus altèrent grandement les localisations subcellulaires dépendantes de PBD.9,10,23 Il convient de noter, cependant, que les trois résidus (His 538, Lys 540 et Trp 414) critiques pour la liaison à la PBD sont conservés parmi les PBD des trois membres de la sous-famille Plk étroitement apparentés (à savoir, Plk1, Plk2 et Plk3). Ainsi, des interactions supplémentaires avec d’autres résidus spécifiques à chaque Plk sont probablement cruciales pour atteindre la spécificité de l’interaction dépendante de la PBD. Les modèles de liaison PBD discutés ici peuvent servir de points de départ dans la génération de pharmacophores qui sont vitalement nécessaires pour le développement de petites molécules de type médicament contre Plk1 PBD.