L’analogue 3-Deoxy de α -GalCer: divulgation du rôle du groupe 4-hydroxyle pour l’activation des cellules NKT médiées par CD1d

KRN7000 (aussi communément appelé α -GalCer, 1, Figure 1) 1) est un analogue structurellement modifié des agelasphines du produit naturel marin1. Ce glycolipide est le premier agoniste défini pour les cellules tueuses naturelles (NKT), et il reste le composé le plus étudié pour l’exploration. de la biologie et de la pharmacologie des cellules NKT.2 − 6 α -GalCer active les cellules NKT d’une manière restreinte CD1d; il se lie d’abord à la molécule CD1d des cellules présentatrices d’antigène, et le complexe α -GalCer / CD1d résultant est alors reconnu par les α β Récepteur des lymphocytes T (TCR) pour former le complexe ternaire qui conduit à l’activation des cellules NKT. Les cellules NKT activées sécrètent rapidement de grandes quantités de cytokines T helper 1 et 2 (Th1 et Th2), telles que l’interféron – γ (IFN – γ) et l’interleukine-4 (IL-4), qui jouent des rôles critiques dans la régulation des réponses immunitaires innées et adaptatives.7 − 9Figure 1Structures des glycolipides 1 – La structure de α -GalCer complexée avec CD1d révèle que les chaînes lipidiques acyle et phytosphingosine de α -GalCer s’encastrent étroitement dans deux poches hydrophobes de la rainure de liaison CD1d, alors que le groupe galactose dépasse de la fente CD1d.10 − 13 Il existe plusieurs interactions de liaison hydrogène entre les résidus de surface de CD1d et les groupes hydroxyle du galactose et de la base de phytosphingosine qui semblent être cruciaux pour maintenir α -GalCer dans la position correcte pour la reconnaissance par le TCR de Cellules NKT.Le réseau de liaison hydrogène dans la structure cristalline est bien adapté aux résultats antérieurs de la structure des études sur les relations d’activité (SAR) des analogues de Galax (6, 14 et 18). la phytosphingosine Le fragment de α -GalCer a montré que l’analogue dépourvu du groupe 4-hydroxyle sur la phytosphingosine (4-désoxy – (2C), Figure 2) montre une activité légèrement réduite en tant que comparé à α -GalCer, alors que l’analogue dépourvu à la fois de groupes 3- et 4-hydroxyle (3,4-didésoxy – α -GalCer, 3, Figure &#1) Figure 1) était inactif. 19 − 22 Ces résultats SAR, ainsi que les interactions de liaison hydrogène observées du groupe 3-hydroxyle de α -GalCer, avec les résidus du CD1d (Asp-80) et du TCR (Arg-95) , a conduit à la croyance générale que le groupe 3-hydroxyle de la phytosphingosine était crucial pour l’activation des cellules NKT, alors que le groupe 4-hydroxyle n’était pas crucial pour l’activité.16,20,23 Cependant, l’analogue ne manque que du groupe 3-hydroxyle sur la phytosphingosine (3-désoxy – α -GalCer, 4, Figure ​ Figure1) 1) n’avait jamais été préparée et évaluée pour déterminer les impacts individuels des groupes 3- et 4-hydroxyle sur les activa tion. Ce manque de données SAR potentiellement importantes nous a incités à synthétiser et évaluer l’analogue 3-désoxy 4. Ici, nous rapportons nos études sur ce sujet. Pour la synthèse de l’analogue 3-désoxy désiré de α -GalCer 4, le On a choisi comme composé de départ idéal le composé 5 (24) dérivé de la d-ribo-phytosphingosine, étant donné que ses groupes 2-amino et 4-hydroxyle étaient déjà convenablement protégés (Schéma 1). Le groupe hydroxyle primaire de 5 a été sélectivement protégé en tant que son éther silylique pour donner le composé 6. Pour éliminer le groupe hydroxyle en C-3, l’alcool 6 a d’abord été converti en bromure 7 avec CBr4 et PPh3. Le bromure 7 obtenu a ensuite été réduit en utilisant NaBH4 et NiCl2 dans EtOH. Dans ces conditions de réaction, le groupe azido de 7 a été réduit concomitamment pour donner l’aminé 8 avec un bon rendement (85%) Schéma 1 Synthèse de 3-désoxy – α -GalCer 4Après élimination réussie du groupe hydroxyle C-3 du ribo -phytosphingosine, le groupe protecteur silylé dans 8 a été éliminé avec Bu4NF pour fournir l’alcool aminé 9. L’acylation de 9 avec l’acide hexacosanoïque et EDCI a donné le céramide 10. Pour la formation sélective de la liaison glycosylée, nous avons utilisé la réaction de glycosylation de Mukaiyama25 impliquant le le fluorure de galactosyle réactif 12 en tant que donneur de glycosyle. Cette réaction fournit le α -galactoside 11 désiré, mais le rendement est très faible (environ 10%). Les tentatives pour augmenter le rendement de 11 en faisant varier le donneur de glycosyle et les conditions de réaction n’ont pas été couronnées de succès.Le faible rendement du produit de glycosylation 11 pourrait être attribué au fait que le groupe amide de 10 diminue la nucléophilie du groupe hydroxyle primaire par liaison hydrogène26. Une approche alternative a donc été imaginée dans laquelle un groupe azido était utilisé à la place de l’amide. pendant la glycosylation. Le groupe amine libre de 9 a d’abord été reconverti en un azide 13 via une réaction modifiée de transfert diazoïque.27 Lorsque le bromure de galactosyle 15 (28) généré in situ a été utilisé comme donneur de galactosyle, la glycosylation de 13 a été réalisée efficacement pour # x003b1; -galactoside 14 comme seul anomère identifiable avec un bon rendement (83%). La réduction de Staudinger du groupe azido de 14 suivie de la condensation de l’amine résultante avec l’acide hexacosanoïque a conduit à la formation de 11. Cette voie a nécessité deux étapes de plus que l’original mais s’est révélée significativement plus efficace et pratique pour la préparation de 11. Enfin, La déprotection globale des éthers benzyliques par hydrogénolyse a donné l’analogue 3-désoxy désiré 4. Pour une évaluation biologique préliminaire de l’analogue 3-désoxy 4, nous avons utilisé des cellules d’hybridome de cellules NKT CD1d (DN32.D3) qui sont des cellules NKT immortalisées et que ont tendance à produire de l’IL-2 après stimulation. Le parent α -GalCer 1 et son analogue 4-désoxy 2 ont également été testés pour la comparaison.29,30 Comme le montre la figure ​ Figure2a, 2a, 4-désoxy analogue 2 ont montré des effets stimulants comparables à &#x003b1 ; -GalCer 1, confirmant les rapports précédents que l’activité de l’analogue 4-désoxy 2 ne diffère pas significativement de celle de α -GalCer.19 Contrairement à l’attente, cependant, l’analogue 3-désoxy 4 était légèrement plus efficace que α -GalCer pour la promotion de la production d’IL-2. Parce que la sécrétion d’IL-2 dépend de CD1d chargé d’antigène 31, ces résultats indiquent que l’analogue 3-désoxy 4 se lie efficacement à CD1d et déclenche la signalisation TCR d’une manière similaire à α -GalCer.Figure 2Evaluation biologique d’analogues désoxy . (a) sécrétion d’IL-2 par des cellules d’hybridome NKT DN32.D3. La production d’IL-2 a été mesurée à partir de surnageants co-cultivés d’hybridome NKT DN32.D3 et de cellules RBL transfectées par CD1d de souris après 16 h de culture. Représentant … Pour déterminer si l’analogue 3-désoxy 4 peut stimuler la libération de cytokines à partir de cellules NKT intactes, nous avons mesuré les niveaux d’IFN – γ et IL-4 dans des surnageants de culture in vitro de splénocytes de souris stimulés avec 8 ng / ml des composés 1, 2 et 4. Figure 2b2b montre l’IFN relatif – γ Comme prévu, l’activité de stimulation NKT de l’analogue 4-désoxy 2 ne différait pas significativement de celle de α -GalCer 1. Notre évaluation a montré que 3 l’analogue de désoxy-4 pourrait induire des réponses de cytokine de cellules NKT de manière similaire à 1. Cependant, le composé 4 semblait biaiser la sécrétion de cytokine vers la réponse Th2; L’analogue 3-désoxy 4 a montré un effet stimulant comparable sur la production d’IL-4 sous forme de α -GalCer 1, alors qu’il a favorisé de plus petites quantités d’IFN – γ La production par rapport à 1. Les résultats biologiques ci-dessus suggèrent que l’analogue 3-désoxy 4 peut être favorablement accueilli dans la rainure de liaison CD1d. Pour comprendre le mode de liaison de 4, nous avons effectué des études de modélisation moléculaire sur l’interaction des analogues 2 et 4 avec CD1d et le TCR NKT.32,33 La structure cristallographique aux rayons X du complexe ternaire α -GalCer / hCD1d / TCR (PDB code 2PO6) 12 a été utilisé pour cette analyse d’amarrage. La meilleure géométrie possible de l’analogue dans le complexe CD1d / TCR a été recherchée en utilisant Surflex-Dock. Les scores d’amarrage des composés étaient en accord partiel avec les données biologiques. L’analogue 3-désoxy 4 a donné un meilleur score d’amarrage que l’autre α -GalCer 1 ou son 4-désoxy analogue 2 (voir Figure S1 dans les Informations de Support), bien que l’analogue 4 forme moins de liaisons hydrogène avec le complexe CD1d / TCR que 1 ou 2 (voir la figure S2 dans les informations de support). Dans notre modèle d’amarrage, l’analogue 4-désoxy 2 occupe pratiquement la même position et forme le même ensemble de liaisons hydrogène que α -GalCer dans son complexe cristallin avec hCD1d / TCR (voir Figure S3 dans les Informations de Support). Cependant, l’analogue 3-désoxy 4 se trouve considérablement plus profondément dans la rainure que α -GalCer 1 comme le montre la figure ​ Figure3a.3a. Le groupe de tête du galactose est décalé latéralement d’environ 1,3 Å L’absence d’un groupe hydroxyle en position 3 semble entraîner le déplacement de la base sphingoïde vers le bas dans la poche pour établir de nouvelles liaisons hydrogène avec le complexe CD1d / TCR (figure ​ Figure 33b). Figure 3 Comparaison du modèle d’ancrage de 3-désoxy – α -GalCer 4 (squelette vert) avec la structure cristalline de α -GalCer 1 (squelette rose) dans le hCD1d / TCR (banque de données sur les protéines) code 2PO6) Les principaux résidus d’acides aminés sont représentés en bleu (résidus TCR) …Bien que les études de modélisation computationnelle ne fournissent pas de preuve concluante, notre modèle offre une vue de la façon dont l’analogue 3-désoxy 4 peut se lier à CD1d et présenter son épitope de galactose au TCR des cellules NKT. Tout au long de ces études de modélisation moléculaire et biologique, l’effet de l’absence du groupe 3-hydroxyle semble être compensé par la présence d’un groupe hydroxyle en position C-4. Ainsi, les groupes 3- et 4-hydroxyle de la phytosphingosine sont individuellement efficaces pour orienter le glycolipide dans CD1d et induire des réponses des cellules NKT, bien que la position du groupe hydroxyle affecte la façon dont le glycolipide se lie au CD1d. En résumé, nous avons préparé le α -GalCer analogue dépourvu du groupe 3-hydroxyle sur la phytosphingosine (3-désoxy – α -GalCer, 4) pour déterminer les impacts individuels des groupes 3- et 4-hydroxyle sur l’activation des cellules NKT. Contrairement à la perception précédente, le 3-désoxy – α -GalCer s’est avéré aussi efficace pour induire les réponses des cellules NKT à la fois α -GalCer et 4-deoxy – α -GalCer. Avec nos études d’amarrage, ce résultat suggère que le groupe 4-hydroxyle de α -GalCer est aussi important que le groupe 3-hydroxyle et que les deux groupes hydroxyle pourraient jouer des rôles à la fois individuels et coopératifs dans l’orientation du glycolipide dans le position correcte dans CD1d pour être reconnu par le TCR des cellules NKT. Nous croyons que 3-deoxy – α -GalCer représente un nouvel outil important pour améliorer la compréhension des interactions glycolipidiques & CD1d et la réponse NKT. De plus, il pourrait fournir des indications sur le développement d’agents immunostimulants non-stéréotypés structurellement distincts du galactosylcéramide contenant de la phytosphingosine. | ​​N | Transformations chimiques produisant des composés avec des profils d’activité distincts