Synthèse et évaluation de 5-Fluoro -2-aryloxazolo [5,4-b] pyridines en tant que β -Ligands amyloïdes PET et identification de MK-3328

maladie d’Alzheimer (AD) est un trouble neurodégénératif progressif qui a été estimé à affliger 26,6 millions dans le monde entier en 20061, et beaucoup d’autres ont été touchés en tant que soignants de personnes atteintes de cette maladie débilitante. Bien que les traitements commercialisés pour la MA améliorent temporairement les symptômes cognitifs chez les patients, ils ne parviennent pas à ralentir significativement la progression de la maladie. Plusieurs nouvelles thérapeutiques sont en cours de développement et pourraient intervenir dans les mécanismes sous-jacents de la MA, et des biomarqueurs permettant de détecter les populations de patients affectées et de mesurer la réponse à ces thérapies sont nécessaires.De nombreux membres de la communauté de recherche sur l’Alzheimer croient qu’une modification réussie de la trajectoire de la maladie pourrait nécessiter une intervention thérapeutique au stade symptomatique de l’atteinte cognitive légère (MCI), avant l’apparition d’une neurodégénérescence potentiellement irréversible.3 Attendu que le diagnostic clinique de la DA par des tests de la cognition est suffisante aux stades avancés, le diagnostic précoce de la MA est moins évident et nécessite des preuves à la fois de perte de mémoire épisodique et de changements de biomarqueurs soutenant les processus pathologiques.4 Des efforts remarquables sont en cours .5 Bien que prometteurs, la plupart des marqueurs prédictifs sont des mesures indirectes de la pathologie sous-jacente ou sont médicalement invasifs. Une approche plus directe et non invasive, en particulier, l’évaluation des dépôts de plaque de β -amyloïde (A β) dans le cerveau via l’imagerie de tomographie par émission de positrons (TEP), a démontré un succès dans les milieux cliniques. À ce jour, plusieurs ligands PET liés à A β ont efficacement différencié AD des patients non-AD. [11C] PIB (1, Figure ​ Figure 11) 6,7 est le ligand PET amyloïde le plus étudié et a récemment été corrélé avec d’autres biomarqueurs cliniques AD8. Bien que pas aussi bien caractérisé que PIB, Astra-Zeneca &#x02019 ; s [11C] AZD2184 (2) est prometteur en tant qu’agent d’imagerie amyloïde chez l’homme, car il a démontré des niveaux plus faibles de liaison non spécifique que PIB dans des études précliniques.9 − 11Figure 1Structures de ligands PET amyloïdes sélectionnés et notre radioligand 8 de référence, [3H3] DMAB.Bien que ces traceurs soient efficaces, la courte demi-vie de 11C (∼ 20 min) limite l’utilisation de [11C] PIB et [11C] AZD2184 aux centres d’imagerie TEP avec des cyclotrons dans leur voisinage immédiat. Comme le 18F a une demi-vie beaucoup plus longue (110 min), les traceurs basés sur le 18F peuvent être utilisés sur des sites d’imagerie TEP beaucoup plus éloignés des sites de production de radionucléides, permettant un meilleur accès aux patients http://www.slimex.eu. Plusieurs programmes de recherche se sont engagés dans la conception et la découverte de ligands PET amyloïde 18F, aboutissant à la découverte de [18F] FDDNP12 (3), GE-067 (Flutemetamol, 4), 13 [18F] AV-1 (Florbetaben, 5) , 14,15 [18F] AV-45 (Florbetapir, 6), 16,17 et AZD4694 (7) .18Basé sur les données précliniques et cliniques disponibles, nous avons estimé qu’un agent d’imagerie amyloïde réussi doit avoir affinité pour la plaque β -amyloïde (Kd < 20 nM) avec une liaison minimale non spécifique afin de fournir un grand signal spécifique pour la détection de la plaque. Le comportement du traceur dans les études d'imagerie in vivo chez des animaux dépourvus de plaque est également important, car le traceur devrait présenter une absorption cérébrale élevée et une cinétique de lavage rapide. Les données publiées sur les candidats ligand amyloïde révèlent que les traceurs hautement lipophiles présentent souvent une rétention élevée dans la substance blanche qui, dans les études d'imagerie, peut affecter le rapport signal / bruit et interférer avec la différenciation des patients AD et non AD15. par exemple, cLogP) est une méthode qui peut être utilisée pour réduire la liaison non spécifique au tissu cérébral.19 Les comparaisons par paire de reliures amyloïdes étroitement apparentées suggèrent que cette approche est valide, comme observé dans le profil de liaison non spécifique amélioré de AZD2184 (cLogP20 = 2,84) versus PIB (cLogP = 3,45) ainsi que AV-45 (cLogP = 3,13) versus AV-1 (cLogP = 3,75). Ici nous rapportons nos efforts dans ce domaine, impliquant la synthèse et l'évaluation de l'oxazolo [5,4-b] les pyridines qui peuvent être marquées avec du 18F en tant qu'agents d'imagerie potentiels pour la plaque d'amyloïde β Pour caractériser la liaison de composés nouvellement synthétisés, un essai de liaison de compétition dans des homogénats de cortex AD humain a été utilisé en utilisant [3H3] DMAB (8) comme radioligand de référence. Ce composé a été identifié par radiomarquage de structures sélectionnées de la collection de composés Merck avec une grande similitude structurelle avec les ligands de la plaque amyloïde de la littérature. [3H3] DMAB (8) a un Kd de 25 nM dans des homogénats de cerveau AD humain avec de faibles niveaux de liaison non spécifique, ce qui en fait un radioligand de référence approprié pour les tests de liaison de compétition. Du point de vue de la conception, 8 a également servi de structure principale dans la conception des 5-fluoro-oxazolo [5,4-b] pyridines présentées dans ce travail. Des composés puissants possédant une faible logP calculée et dépourvus de susceptibilité à la glycoprotéine P (P-gp) ont été radiomarqués au tritium pour examen dans des dosages de liaison in vitro plus détaillés et avec 18F pour l'évaluation dans des études de PET singe rhésus. Parce que le [11C] PIB ne se lie pas avec une forte affinité pour la plaque dans le cerveau singe rhésus, 21 nous n'avons pas utilisé des modèles animaux de AD dans des expériences d'imagerie in vivo pour prédire le comportement des candidats traceurs chez les patients.Scheme 1Unlabeled oxazolo [5,4- b] des analogues de pyridine ont été synthétisés à partir de la 3-amino-2,6-difluoropyridine 10a (22) (Schéma 1) et une variété d'acides carboxyliques 9 disponibles dans le commerce et préparés.Activation des acides carboxyliques 9 avec Ghosez ’ le réactif 23, suivi d'une réaction avec 10a en présence d'un excès de pyridine, a donné des amides de type lia. Des banques focalisées ont été préparées par concentration parallèle des mélanges réactionnels bruts et passage direct dans l'étape suivante; cependant, les conversions étaient généralement plus élevées si les amides étaient d'abord isolés et purifiés, en utilisant une Chromatographie ou une précipitation après l'addition d'eau. Les méthodes acides précédemment décrites pour la conversion des amides de type 11a en oxazolo [5,4-b] pyridines étaient médiocres, 24 cependant, le chauffage par micro-ondes des amides 11a avec K2CO3 ou Cs2CO3 dans le DMF a donné l'oxazolo ciblé [5,4- b] pyridines 12a, typiquement avec une conversion élevée. Dans les cas où le carboxylate de départ 9 contenait un N2 libre, les cyclisations induites par la base ne se sont pas déroulées, nécessitant une protection avec un groupe Boc ou p-méthoxybenzyle qui soit spontanément déprotégé pendant le chauffage soit éliminé par la suite avec l'acide trifluoroacétique. La synthèse de précurseurs marqués au 18F a été réalisée par la même voie, en substituant la 3-amino-2,6-dichloropyridine 10b disponible dans le commerce dans la première étape, conduisant à des 5-chloro-oxazolo [5,4-b] pyridines de type 12b. Le chauffage au micro-ondes avec du [18F] KF et du Kryptofix 2.2.2 dans du DMSO a ensuite donné du [18F] 12a. SAR précédemment rapporté dans les classes de 2-arylbenzazole de A β ligands de la plaque ont suggéré que 4- et 3,4-substitutions sur le cycle 2-aryle sont nécessaires pour une forte affinité amyloïde, 25 tandis que 2- et substitutions 6 sont délétères, de sorte que nos propres efforts principalement axés sur les positions 3 et 4 (Tableau 1). Alors que les analogues 4-méthoxyphényl (13) et 4-méthylaminophényl (14a) ont démontré une puissance modérée avec des valeurs de clogP modérées à élevées, l'analogue diméthylamino 14b présentait une liaison puissante, avec seulement un clogP légèrement supérieur à 14a. Des tentatives pour modérer la lipophilie par incorporation d'un cycle d'azote, comme dans les analogues de pyridine 15a et 15b, ont entraîné une perte d'affinité de liaison. Contraindre le 4-substituant dans un cycle conduit à des analogues d'indole 16a et 16b, qui étaient puissants au prix d'une lipophilicité légèrement élevée. Alors que la substitution aza des composés 4-aminophényl était délétère pour la puissance de liaison, la substitution 7-aza des indoles 16a − b, donnant les azaindoles 17a et 17b, n'a causé qu'une perte de 2 fois de la puissance de liaison tout en abaissant le clogP par une unité complète. Les analogues de N-méthyle (14b Ȣ 17b) avaient tendance à présenter une puissance de liaison améliorée par rapport à leurs analogues de des-méthyle respectifs (14a 𝵤 17a). De nombreuses formes étroitement apparentées et isomères des indoles actifs (16a, b) et des azaindoles (17a, b) ont été étudiées; cependant, le meilleur de ces composés était 2 à 5 fois moins puissant (18 𶐄 22) et, dans la plupart des cas, était complètement inactif (par exemple, 23 𢈒 24). Tous les composés évalués pour la sensibilité de la P-gp humaine dans cette série n'étaient pas des substrats (rapport de transport P-gp < 3) et présentaient une perméabilité passive élevée (Papp > 20 × 10 − 6 cm / s), y compris les composés de plomb 14b, 16b et 17b.26 Tableau 1Affinité des 5-fluoro-2-aryloxazolo [5,4-b] pyridines pour les dépôts de plaque humaine et amyloïdePour caractériser complètement les caractéristiques de liaison de 14b, 16b et 17b, leurs analogues [3H3] méthyle correspondants ont été préparés en utilisant la déprotonation médiée par l’hydrure de sodium de 14a, 16a et 17a, respectivement, suivie d’une réaction avec l’iodure de [3H3] méthyle. Des études de liaison par saturation ont été menées en utilisant des homogénats de cortex AD, auxquels les trois composés présentaient une liaison puissante et saturable (tableau 2). Alors que 14b et 16b présentaient une liaison plus puissante et des rapports Bmax / Kd plus élevés par rapport à 17b, ce dernier composé présentait des niveaux plus faibles de liaison ininterrompue dans les homogénats cérébraux AD, estimés comme le pourcentage de liaison totale au Kd en présence de 2 &#x003bc M composé non marqué. La diminution du niveau de liaison non spécifique associée à 17b est cohérente avec l’hypothèse selon laquelle la liaison non spécifique au tissu cérébral est corrélée à la lipophilicité. Tableau 2: Affinité des paires 14b, 16b et 17b marquées au tritium par rapport aux homogénats cérébraux AD de trois donneurs Des coupes de cerveau AD ont été utilisées pour différencier davantage les composés de plomb marqués au tritium (Figure ​ (Figure2) .2). Alors que [3H3] 14b, [3H3] 17b, et le contrôle positif [3H3] PIB ([3H3] 1) 9 présentaient un schéma de liaison ponctué, [3H3] 16b a échoué à plusieurs reprises, vraisemblablement en raison d’une combinaison d’élévation non spécifique liaison et une haute affinité du composé pour les plastiques de laboratoire (figure 2, 2, colonne a.) Auto-bloc avec 1 μ M composé parent non marqué a été utilisé pour évaluer la liaison non spécifique (Figure &#x200B (Figure2,2, colonne b).Dans tous les cas, la liaison ponctuée n’a pas été observée en présence d’une concentration saturante de composé parent non marqué; cependant, tous les composés présentaient un certain degré de liaison de fond diffus. Qualitativement, le rapport de liaison spécifique à non spécifique de [3H3] 17b semble être meilleur que celui de [3H3] 14b, suggérant que 17b pourrait être un meilleur agent de diagnostic amyloïde in vivo. Figure 2 (a) Images autoradiographiques du cortex humain AD après traitement avec un composé marqué au [3H3] 5 nM. (b) Images autoradiographiques du cortex humain AD après traitement avec un composé marqué au [3H3] 5 nM en présence de composé M non marqué (auto-blocage). En utilisant la chimie délimitée dans le schéma 1, des versions marquées au 18F de 14b, 16b et 17b ont été préparées pour l’évaluation in vivo des études d’imagerie TEP chez des singes rhésus anesthésiés sains pour évaluer la cinétique d’absorption et de lavage du cerveau. [18F] 17b est représenté sur la figure ​ Figure 33.27 Ici, le traceur a démontré un pic d’absorption cérébrale élevé de ca. 2.7 unités de valeur d’absorption normalisées (SUV) dans le cortex et ca. 3,0 SUV dans le cervelet. Comme souhaité, [18F] 17 a été lavé rapidement, avec moins de la moitié de l’absorption de pic présente dans le cortex et le cervelet à 90 min. Chez les humains présentant une pathologie AD, les dépôts de plaques amyloïdes se manifestent dans le cerveau, y compris le cortex, mais pas dans le cervelet avant les phases terminales de la maladie28. La corrélation étroite entre les courbes d’activité du cervelet et du cortex est souhaitable. suggère que le cervelet sera probablement une région de référence appropriée dans les études d’imagerie clinique. Dans l’image résumée de 90 minutes (figure ​ figure 3b), 3b), les régions corticales montrent un manque de points chauds correspondant à la rétention de la substance blanche. Au préalable, cela peut suggérer que l’approche de minimisation de la liaison de la substance blanche par le ciblage de ligands amyloïdes moins lipophiles est valide. La question de savoir si ce manque de rétention de la substance blanche dans le rhésus se traduira par une imagerie clinique chez l’humain est un sujet d’étude future.Figure 3 (a) Decay corrected time − courbes d’activité du [18F] 17b dans le cortex (cercles rouges), cervelet (carrés bleus) et blancs (diamants noirs). (b) Image de PET de rhésus à l’IRM à 45 &#x02212, 90 min avec [18F] 17b. Le cervelet a été utilisé comme base … En conclusion, nous avons étudié les 5-fluoro-2-aryloxazolo [5,4-b] pyridines en tant que ligands PET potentiel -amyloïde. Après le criblage des composés nouvellement synthétisés pour leur affinité avec les homogénats cérébraux AD, le 17b (MK-3328) a été identifié comme un candidat prometteur, présentant une puissance de liaison amyloïde équilibrée avec de faibles taux de liaison non spécifique. In vivo, le [18F] 17b présente une cinétique favorable, présentant une absorption cérébrale élevée et un bon lavage dans des études d’imagerie par TEP de singe rhésus normales. Des essais cliniques humains visant à évaluer le [18F] MK-3328 en tant que ligand PET à base de 18F sont actuellement en cours et seront rapportés en temps voulu.