Découverte des urines 3,5-diamino-1,2,4-triazole en tant qu’inhibiteurs puissants de la kinase anaplasique kinase

La lymphome kinase anaplasique (ALK) a été identifiée pour la première fois dans le cadre de la nucléophosmine (NPM) ) – protéine de fusion ALK dérivée d’une translocation chromosomique détectée chez la majorité (60%) des patients atteints d’un lymphome anaplasique à grandes cellules (ALCL) 1 − 3 La protéine associée aux microtubules d’échinoderme 4 (EML4) a été découverte comme nouveau partenaire de fusion avec ALK chez environ 5% des patients atteints d’un cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC) .4,5 Les translocations chromosomiques impliquant le gène ALK à 2p23 avec de nombreux gènes partenaires conduisent à l’activation constitutive du domaine kinase et dans un “ oncogene- accro et # x0201d; état dans plusieurs tumeurs, y compris les tumeurs myofibroblastiques inflammatoires (IMT), 6,7 lymphome diffus à grandes cellules B (DLBCL), 8 et le carcinome spinocellulaire. Récemment, il a également été découvert que les mutations germinales dans ALK sont la cause de la majorité des cas de neuroblastome héréditaire et que l’activation de ALK par mutation et / ou amplification génique est fonctionnellement pertinente dans le neuroblastome sporadique à haut risque.9,10 Études pharmacologiques utilisant le inhibiteur puissant de l’ALK, 5-chloro-N4- (2- (isopropylsulfonyl) phényl) -N2- (2-méthoxy-4- (4- (4-méthylpipérazin-1-yl) pipéridin-1-yl) phényl) pyrimidine- La 2,4-diamine (1, TAE684) a fourni une validation préclinique pour cibler l’activité de la kinase ALK pour le traitement des tumeurs ALK-dépendantes NPM-ALK, EML4-ALK et de mutation ponctuelle.10 − 13 Au total, ces résultats suggèrent que le développement d’inhibiteurs de l’ALK à petites molécules fournirait des thérapeutiques efficaces pour les malignités hématologiques et les tumeurs solides dirigées par ALK2. Actuellement, aucun inhibiteur de l’ALK à petites molécules n’est approuvé pour la thérapie clinique contre le cancer; cependant, un double inhibiteur de c-Met / ALK [(R) -3- (1- (2,6-dichloro-3-fluorophényl) éthoxy) -5- (1- (pipéridin-4-yl) -1H-pyrazol -4-yl) pyridine-2-amine, 2, PF-2341066] est actuellement en cours d’étude dans un essai clinique de phase II / III dans l’ALCL, le NSCLC et le neuroblastome.14 A ce jour, l’activité clinique a été observée dans EML4-ALK Comme le composé 2 a été développé à l’origine en tant qu’inhibiteur de c-Met, sa puissance cellulaire contre ALK est seulement modérée (IC50 ∼ 200 nM), et plusieurs mutations de résistance ont été récemment rapportées. 17,18 Par conséquent, le développement d’inhibiteurs puissants et sélectifs de ALK de type sauvage et mutant pour le traitement des cancers ALK-positifs est urgent. Dans cette lettre, nous rapportons la conception et la synthèse de 3,5-diamino-1,2,4-triazole benzylurée en tant qu’inhibiteurs compétitifs de l’ALK de l’adénosine triphosphate (ATP). La structure cellulaire et les études de relation d’activité (SAR) ont guidé la découverte de 15a, 20a et 23a, qui présentent une puissante activité inhibitrice dans les cellules Ba / F3 transformées par ALK, les cellules ALCL NPM-ALK-positives et mutées par ALK. Récemment, deux groupes indépendants ont rapporté la structure cristalline du domaine kinase ALK dans un complexe avec des inhibiteurs compétitifs de l’ATP19,20. A ce jour, des inhibiteurs de l’ALK à petites molécules ont été décrits à partir de l’aminopyridine, pyridone, indolocarbazole, dianilinopyrimidine, acylamino- indazole et classes de 1H-pyrrolo [2,3-b] pyrazine.2,14,21 Pour concevoir une nouvelle classe d’inhibiteurs de l’ALK, nous avons exploré les 3,5-diamino-1,2,4-triazole urées, qui peuvent être considérées comme un amalgame moléculaire des 2,4-dianilinopyrimidines, telles que 1 , 11 et 1-acyl-1H- [1,2,4] -triazole-3,5-diamine 3 (22) (figure ​ (figure 1) .1). Le composé 1 est un inhibiteur très puissant de la prolifération des cellules NPM-ALK-Ba / F3 (IC50 = 3 nM). A l’origine, des études de modélisation et ensuite des structures de cocristaux (code PDB: 2XB7) ont démontré que 1 occupe le site de liaison à l’ATP et utilise le motif aminopyrimidine pour former deux liaisons hydrogène à la charnière ALK “ segment.11 Le composé 3 a été découvert en tant qu’inhibiteur puissant de la kinase cycline-dépendante 1 (CDK1) avec une CI50 de 4,8 nM, mais nous avons émis l’hypothèse qu’il pourrait présenter une affinité pour ALK en raison de sa faible activité (IC50 = 2,4 μ ). Le chémotype 4 a été conçu comme un hybride d’aminopyrimidine 1, d’aminopyridine 2 et de 1,2,4-triazole-3,5-diamine 3. La triazole-3,5-diamine a été utilisée comme structure principale avec le potentiel de former trois liaisons hydrogène avec le segment charnière. L’appendice acyle de 4 était destiné à être capable d’atteindre soit vers l’avant analogue à l’isopropylphénylsulfone de 1 ou vers l’arrière de la poche de liaison de l’ATP analogue à la moitié dichlorophényle de la figure 2. Stratégie de conception de l’échafaudage.Pour valider notre conception stratégie, une petite série d’analogues de l’3,5-diamino-1,2,4-triazole urée représentant le chémotype 4 a été synthétisé en utilisant une voie de synthèse concise en quatre étapes (Schéma 1). L’ortho-méthoxyaniline a été mise à réagir avec le diphénylcyanocarbonimidate, et l’intermédiaire résultant a ensuite été cyclisé en réagissant avec l’hydrazine pour donner le triazole correspondant 7. Ce triazole a ensuite été acylé avec les chlorures benzylcarbamiques substitués pour donner un régioisomère majeur et un isomère mineur. Les structures de ces deux produits régioisomères ont été attribuées sur la base de la littérature 22, de la spectroscopie RMN et de l’analyse par cristallographie aux rayons X d’un analogue représentatif 29 (tableau 3). Contrairement aux rapports de la littérature 22, le régioisomère majeur s’est avéré être l’isomère 2-acylé pour la majorité des analogues qui sont rapportés ci-dessous.Scheme 1Les composés 14   ont été testés contre Tel-ALK-Ba / F3, EML4- ALK-Ba / F3 et les lignées cellulaires Ba / F3 parentales. Nous avons été surpris par l’absence totale d’activité inhibitrice de l’ALK de l’aniline-1,2,4 triazole-urée illustrée par les composés 14a et 14b. Sur la base de la modélisation moléculaire et du potentiel de restriction limitant les liaisons hydrogène intramoléculaires, nous avions prévu que ces composés présenteraient un certain niveau d’inhibition de l’ALK. Cependant, l’introduction d’un autre espaceur à un atome de carbone dans la chaîne latérale de l’aniline-urée conduit au régioisomère 1-acylé 15a, qui possède des valeurs IC50 de 70 et 140 nM contre Tel-ALK-Ba / F3 et EML4-ALK-Ba / F3, respectivement, et n’était pas cytotoxique pour la cellule parentale Ba / F3 (IC50 > 10 μ M). Le composé 16a, possédant un espaceur à deux atomes de carbone dans la chaîne latérale de l’urée, présentait une puissance de Tel-ALK multipliée par 6 (IC50 = 450 nM). Les deux régio-isomères 2-acylés 15b et 16b étaient beaucoup moins puissants avec des valeurs IC50 de 7300 et 1900 nM, respectivement. Ces résultats indiquent que la longueur appropriée de l’espaceur et la position de l’acylation sont les déterminants clés pour obtenir une puissante activité inhibitrice de l’ALK. Nous avons pensé que la chaîne latérale de benzylamine-amine acylée en position 1 fournissait le meilleur ajustement à la poche arrière hydrophobe lorsque l’anneau hétérocyclique central était réduit de six (comme dans les composés 1 et 2) à cinq (comme dans le composé 4) Encouragés par ce résultat, une série d’urées de 3,5-diamino-1,2,4-triazole a été synthétisée et testée pour la puissance antiproliférative dans les cellules Tel-ALK-Ba / F3 et EML4-ALK-Ba / F3. Nous avons d’abord étudié la fraction acyle de cette structure en substituant le groupe méthylsulfonyle à différentes positions (ortho, méta et para) du cycle benzyle, ce qui donne les composés 17a, 19a et 17b & 19b. Alors que 17a maintenait une puissance modérée contre la cellule EML4-ALK-Ba / F3 (CI50 = 0,61 μ M), les autres ont perdu substantiellement la puissance inhibitrice de ALK (Tableau 1). Ceci suggère que la substitution ortho du cycle benzyle est critique pour obtenir une inhibition puissante de ALK. Lorsque la 2-isopropylsulfonylbenzylamine a été remplacée par la 2,6-dichlorobenzylamine, le composé résultant 20a présentait une puissance améliorée avec une CI50 de 40 nM contre les cellules Ba / F3 transformées par Tel-ALK, mais il a également inhibé les cellules parentales Ba / F3 avec une CI50. de 3,5 μ M, ce qui suggère que des cibles supplémentaires ont été engagées qui ont contribué à la cytotoxicité non spécifique. De façon intéressante, le produit 2-acylé 20b présentait également une activité inhibitrice (CI50 = 480 nM), bien qu’avec une puissance réduite de 10 fois. Le composé 21a possédant une chaîne latérale de 2,6-dichloro-3-fluoro-méthylbenzylamine adoptée à partir du composé 1 (23) présentait une puissance Tel-ALK environ 10 fois plus faible.Le remplacement de la benzylurée NH par un substituant N-méthyle (22a) a entraîné une forte diminution de la puissance cellulaire (IC50 = 7,4 μ M), suggérant que ce groupe pourrait être responsable d’un contact critique avec l’enzyme. Les composés de thio-urée correspondants (23a, 23b et 24a) présentaient une puissante activité inhibitrice de ALK, mais les deux 23b et 24a possédaient également une puissante cytotoxicité non spécifique envers les cellules Ba / F3 parentales. Comme on le verra plus loin, ceci peut être lié aux thio-urées présentant un profil de sélectivité des kinases significativement élargi.Tableau 1SAR de la fraction 1-acyle pour ALKNext, nous avons étudié la conséquence de la variation de la chaîne latérale de l’aniline en position 3, 2,4-triazole (tableau 2). Ici, nous avons découvert que le substituant 2-alkyloxy sur le cycle aromatique aniline a servi de poignée pour contrôler la sélectivité de la kinase comme indiqué pour 1 (11) et (R) -4 – ((8-cyclopentyl-7-éthyl-5-méthyl- 6-oxo-5,6,7,8-tétrahydroptéridin-2-yl) amino) -3-méthoxy-N- (1-méthylpipéridin-4-yl) benzamide (BI-2536) 24 (voir la discussion sur la sélectivité des kinases) . La progression du 2-méthoxy (15a) en 2-éthoxy (25a) en 2-isoproxy (26a) a entraîné une diminution progressive de la puissance cellulaire Tel-ALK. En utilisant la queue d’aniline adoptée à partir de 1, le composé 27a présentait une activité Tel-ALK légèrement diminuée (CI50 = 220 nM). Le remplacement par la 4-méthoxycarbonyl-2-méthoxy aniline et la 4-bromo-2-méthoxy aniline a donné les composés 28a et 29a avec des valeurs IC50 de 520 et 4000 nM, respectivement. Ceci suggère que le groupe fonctionnel 4-N-méthylpipérazine est important pour atteindre l’activité cellulaire. Encore une fois, seuls les régioisomères 1-acylés présentaient une activité cellulaire, et la plupart des régioisomères 2-acylés (15b, 25b, 26b, 28b et 29b) étaient inactifs à l’exception de 27b, qui possédait une CI50 de 1 μ M. Pour corroborer l’attribution de la structure, nous avons cristallisé avec succès les deux isomères de 29a et 29b, qui possèdent un atome de brome lourd. L’affectation structurelle pour les autres composés a été faite en comparant les signaux RMN 1H des protons des groupes 3-amino (NH) et 5-amino (NH2) aux protons correspondants de 29.Table 2SAR de substitution sur 3-amino pour ALKLa fonction du groupe 5-amino (NH2) a également été étudiée dans le contexte de la série des composés 2- (isopropylsulfonyl) benzyle et 2,6-dichlorobenzyle (tableau 3). En raison de la difficulté de la séparation des isomères, les analogues 5-N-isopropyle (30 et 31) et les analogues des-amino (32) ont été testés en tant que mélange des deux isomères acidose. Tous les composés ont montré une puissance considérablement réduite, ce qui suggère que le groupe 5-amino peut faire une liaison hydrogène supplémentaire à la charnière de la kinase.Table 3SAR de substitution sur 5-Amino pour ALKL’exploration SAR de 3,5-diamino-1,2, 4-triazole urée échafaudage a révélé que l’espaceur un carbone de la chaîne latérale de l’urée (n = 1), 1-acyl substitution, et le groupe 2-méthoxy de la chaîne latérale de l’aniline avec N-méthylpyparazine étaient des caractéristiques structurelles clés nécessaires pour atteindre puissant activité cellulaire contre Tel-ALK et EML4-ALK. Pour mieux comprendre l’effet caractéristique de la structure, nous avons effectué une étude de modélisation moléculaire en utilisant Glide25 basé sur la structure de la structure cellulaire de l’ALK avec 1 (code PDB: 2XB7) 20 (voir les informations de support pour une étude de modélisation détaillée). puissance inhibitrice de ces nouveaux inhibiteurs de l’ALK kinase contre différentes fusion ALK et kinases ALK mutantes, les composés les plus puissants (15a, 20a et 23a), ainsi que 1 et 2, ont été testés contre un panel de lignées cellulaires incluant des cellules NSCLC. lines5 (EML4-ALK-Ba / F3, EML4-ALK (F1174L) -Ba / F3 et EML4-ALK (L1196M) -Ba / F3), une lignée cellulaire ALCL NPM-ALK positive (SU-DHL-1), 26 et des lignées cellulaires de neuroblastome [KELLY (F1174L), SH-SY5Y (F1174L) et SMS-KCN (R1275Q)] (Tableau 4). Ces lignées cellulaires sélectionnées étaient sensibles à l’activité inhibitrice de croissance de 15a, 20a et 23a mais à des degrés différents. Ceci reflète probablement une combinaison des profils de sélectivité de la kinase de ces composés et du degré d’addiction à la puissance de la kinase ALK dans ces différentes cellules. Les composés 15a et 23a possédaient des valeurs IC50 submicromolaires sur l’ensemble du panel de lignées cellulaires à l’exception de SMS-KCN (R1275Q), qui était résistante au composé 1. Tableau 4 Activité antiproliférative de composés sélectionnés contre un panel divers de lignées cellulaires ALK-positives. Nous avons évalué la sélectivité de cet échafaudage en utilisant la méthodologie KINOMEscan à travers un panel de 402 kinases (Ambit Biosciences, San Diego, CA) .27 Cinq composés, 15a, 20a, 24a, 25a, et 26a, ont été criblés à une concentration de 10 μ M, qui a révélé un nombre significatif de cibles potentielles de kinase pour cette classe d’inhibiteur (veuillez consulter les données de profilage Ambit de l’information de support pour plus de détails). Le composé 20a a une activité légèrement meilleure que le composé 15a, mais 20a présente moins de sélectivité avec le score de sélectivité KINOMEscan S10 de 0,31 (123/402) comparé à 15a avec le S10 de 0,21.De même, par rapport à 20a, la thio-urée 24a a une meilleure efficacité contre ALK mais possède également une sélectivité considérablement réduite avec S10 de 0,62, ce qui pourrait être la raison de sa cytotoxicité pour les cellules Ba / F3 parentales. Le substituant 2-alkyloxy sur le cycle aromatique de la chaîne latérale 3-aniline sert de poignée de sélectivité mise en évidence par les S10 de 15a, 25a et 26a, qui sont de 0,21, 0,13 et 0,06, respectivement. Ceci est cohérent avec la constatation que le groupe ortho-méthoxy attaché au substituant 2-aniline dans 1 offre sa sélectivité de ALK par rapport à d’autres kinases testées.11 Pour comparaison, l’échafaudage 3,5-diamino-1,2,4-triazole urée possède une sélectivité globale améliorée par rapport à l’échafaudage 2,4-dianilinopyrimidine illustré par 1 [S10 = 0,66 (231/353)] En conclusion, 15a, 20a et 23a représentent un nouveau chémotype capable d’inhiber efficacement l’ALK. Les forts effets inhibiteurs sur un panel de lignées cellulaires cliniquement significatives avec mutation ALK ont été observés, suggérant le potentiel de cette série chimique pour le développement de médicaments pour le traitement de maladies telles que le NSCLC, l’ALCL et le neuroblastome. Malgré le nombre relativement important de kinases qui peuvent être ciblées par cet échafaudage, des composés comme 15a, 20a et 23a ne sont pas des agents cytotoxiques généraux, comme en témoigne le manque de cytotoxicité envers les cellules Ba / F3 parentales. Plusieurs défis doivent être surmontés pour développer davantage cette série chimique, y compris la sélectivité des kinases, la stabilité chimique de la liaison acyltriazole et les méthodes de synthèse pour produire le régioisomère désiré.