Caractérisation des virus grippaux A / HN multirésistants déposés durant l’année par un enfant immunodéprimé

Contexte Le développement de la résistance aux médicaments grippaux est un problème important chez les enfants immunodéprimés qui pourrait entraîner l’échec du traitement et la transmission virale à d’autres personnes. Méthodes Un total d’isolats d’influenza A / HN a été récupéré sur une période d’un an chez un enfant immunodéprimé initialement traité à l’oseltamivir. Les phénotypes de susceptibilité à l’oseltamivir, au zanamivir et au péramivir ont été évalués par des tests d’inhibition de la neuraminidase NA, et l’analyse séquentielle des principaux gènes viraux, M, NA et hémagglutinine [HA], a été réalisée. Un variant de la grippe A avec des mutations NA EG, EV et IV a d’abord été détecté après des jours de traitement à l’oseltamivir. Dans un test d’inhibition de NA, ce variant était plus résistant à l’oseltamivir que l’original. isoler mais était sensible au zanamivir. Remarquablement, la mutation EV a persisté pendant des mois après l’arrêt de l’oseltamivir. L’amantadine a conduit à l’émergence rapide de la mutation M SN, qui est connue pour conférer une résistance à l’amantadine. Le patient excrète le virus par intermittence tout en recevant un traitement par nébulisation de zanamivir malgré l’absence de phénotype de résistance, qui pourrait résulter d’une délivrance non optimale et d’une immunité réduite de l’hôte. Cette étude souligne le potentiel d’émergence et de persistance d’isolats grippaux multirésistants chez les sujets immunodéprimés même après l’arrêt du traitement, renforçant le besoin de développer de nouveaux composés anti-grippaux

Les virus grippaux A causent une morbidité et une mortalité significatives chez les humains Ces infections sont particulièrement sévères chez les greffés, chez qui elles ont été associées à un taux élevé de complications pulmonaires et à un risque accru de dysfonctionnement et de rejet . Les virus grippaux peuvent également prédisposer les sujets immunodéprimés En outre, les receveurs de greffe peuvent présenter une excrétion prolongée de virus grippaux, souvent malgré un traitement antiviral. Deux classes d’agents antiviraux ont été utilisées pour contrôler les infections grippales, y compris les infections grippales. M inhibiteurs des canaux ioniques et inhibiteurs de la neuraminidase inhibiteurs de la neuraminidase L’utilisation des inhibiteurs M de l’amantadine et de la rimantadine, efficaces seulement contre les virus grippaux A, est associée à l’émergence rapide de mutations pharmacorésistantes aux codons,, ou de la protéine M [, En outre, la résistance naturelle aux inhibiteurs M a augmenté ng; % de virus grippaux A / HN isolés aux États-Unis durant la période – hébergeant la mutation de résistance M SN De nombreux isolats humains récents de virus grippaux A / HN hautement virulents expriment également une résistance primaire à ces médicaments Variantes amantadine-résistantes sont génétiquement stables, pathogènes et peuvent être transmis d’une personne à l’autre Le zanamivir inhalé et l’oseltamivir, un médicament biodisponible par voie orale, sont les seuls inhibiteurs de la NAI actuellement approuvés Autres NAI biodisponibles oralement, comme le peramivir et A- , sont à divers stades de développement Jusqu’à présent, il y a eu peu de signalements de virus grippaux B ayant une sensibilité réduite au zanamivir Des souches résistantes à l’oseltamivir ont été rarement détectées dans les essais cliniques, avec une fréquence estimée de% -% et% -% chez les adultes et les enfants, respectivement, traités dans un cadre ambulatoire Cependant, une incidence plus élevée allant jusqu’à% de la résistance à l’oseltamivir a été récemment rapportée chez des patients hospitalisés japonais. Enfants On a montré que les souches résistantes à l’oseltamivir contenaient des substitutions de neuraminidase NA aux résidus, et dans les virus influenza A / HN et au résidu HY dans les virus influenza A / HN et grippe A / HN [,,,] Dans cette étude, nous rapportons l’évolution moléculaire des virus grippaux A / HN associés à la multirésistance aux médicaments chez un enfant immunodéprimé.

Matériaux et méthodes

Patiente En mai, l’enfant a reçu un diagnostic de SCID à l’âge de plusieurs mois et a rapidement reçu une greffe allogénique de cellules souches haploïdiques de son père. En raison de son absence de greffe, elle a reçu une deuxième greffe de cellules souches en novembre. Elle a eu besoin de reinfusion de cellules CD en janvier, ce qui a entraîné une meilleure prise de greffe. Elle a été traitée avec des stéroïdes et du mycophénolate mofétil en raison de la maladie cutanée du greffon contre l’hôte de juin à juin et de stéroïdes seulement. a eu une diarrhée chronique légère due au rotavirus de juin à février. Elle a également développé une infection chronique des voies respiratoires inférieures due au type de parainfluenza humain depuis le diagnostic du SCID jusqu’à juste après la marche de greffe plus réussie qui a été traitée avec de la ribavirine inhalée pendant une période de moisInfection avec la grippe A a été diagnostiquée en avril et a évolué vers une pneumonite chronique de la lingula. Elle a été initialement traitée avec la dose recommandée d’oseltamivir mg / kg / dose, plusieurs fois par jour [mg, par jour] pendant des semaines, avec quelques améliorations. Cependant, les symptômes cliniques ont réapparu et la culture virale En raison de la présence de nodules et d’infiltrats sur la tomodensitométrie thoracique, un lavage broncho-alvéolaire a été effectué et la culture de l’échantillon a été positive pour la grippe A et A fumigatus en août point de côté. Le patient a également reçu de l’amphotéricine B liposomale et de la caspofungine, suivie d’un traitement suppressif par le voriconazole pour aspergillose. Le patient et sa famille ont été vaccinés avec le vaccin antigrippal inactivé à l’aide d’un nébuliseur d’oseltamivir. Novembre Elle a reçu une autre perfusion de cellules souches en janvier à cause de mauvaise reconstitution immunitaire et infection persistante du virus de la grippe En juillet, la patiente est toujours lymphopénique × cellules / L, principalement des lymphocytes T et a une maladie chronique du greffon contre l’hôte, qui est traitée avec des stéroïdes prednisone, mg fois par jour. toux sans besoin d’oxygène supplémentaire pendant la prise de zanamivir nébulisé Les résultats de ses cultures virales les plus récentes de juin, juillet et août ont été négatifs pour la grippe

Figure Vue largeTéléchargement Caractérisation phénotypique et génotypique des virus grippaux A / HN récupérés chez un enfant immunodéprimé traité par l’oseltamivir, l’amantadine et le zanamivir Toutes les cultures de grippe A ont été réalisées par aspiration nasopharyngée, à l’exception des échantillons de lavage broncho-alvéolaire obtenus en juin et août. SO, non applicable en raison d’un résultat de culture de grippe négatif; ND, non déterminé aExemple positif pour le virus grippal A par test de détection d’antigèneFigure Vue détailléeDisque de téléchargement Caractérisation phénotypique et génotypique des virus grippaux A / HN récupérés chez un enfant immunodéprimé traité par oseltamivir, amantadine et zanamivir Toutes les cultures de grippe A ont été réalisées par aspiration nasopharyngée, avec l’exception des échantillons de lavage broncho-alvéolaire obtenus en juin et août NA, non applicable en raison d’un résultat de culture de grippe négatif; ND, non déterminé aEchantillon positif pour virus grippal A par test de détection d’antigèneVirus isolés Des prélèvements nasopharyngés ou des échantillons de lavage broncho-alvéolaire ont été testés pour la présence de virus grippaux par culture virale sur des cellules rénales canines Madin-Darby Un maximum de passages a été effectué phénotypique et génotypique L ‘ADN complémentaire a été synthétisé en utilisant des amorces hexamères aléatoires Amersham Pharmacia Biotech et l’ ADNc Viral de la transcriptase inverse SuperScript II GIBCO – BRL a été amplifié par PCR en utilisant le système d ‘ARN viral QIAamp Qiagen. Pfu Turbo Polymérase Stratagène et NA-, hémagglutinine HA et amorces M-spécifiques dans des conditions standard Les séquences nucléotidiques des produits de PCR ont été déterminées en utilisant un séquenceur d’ADN automatique ABI Prism séquenceur d’ADN; Clonage des produits de PCR Pour estimer les proportions relatives des gènes WT et mutants de type sauvage dans certains isolats cliniques, les produits de PCR ont été clonés par ligature à extrémité émoussée dans le vecteur pBluescript II KS Stratagene, et au moins des plasmides recombinants portant les gènes d’intérêt ont été sélectionnés au hasard et soumis à une analyse séquentielle Des virus grippaux sélectionnés ont également été purifiés sur plaque une fois avant l’analyse de séquence. Tests de susceptibilité Les cellules rénales canines Madin-Darby ont été inoculées avec des unités de virus par puits dans des puits pour des essais classiques de réduction de plaque. L’inhibition de NA a été testée avec des unités de fluorescence du virus en présence de dilutions en série de demi-log de nmol / L de zanamivir, oseltamivir carboxylate synthétisé chez GlaxoSmithKline, Stevenage, Royaume-Uni, et peramivir / BCX- BioCryst The methylumbelliferyl-N-acetylneuraminic L’acide Sigma a été utilisé comme substrat fluorescent Hemagglutination et élution Hemagg Les dosages de lutéination ont été réalisés dans des plaques de microtitration à fond U en utilisant μL d’une suspension de globules rouges humains et μL de dilutions en série du virus dans du sérum physiologique tamponné au phosphate. Les plaques ont été incubées en hémoglobinurie. ou présence de μmol / L de zanamivir comme décrit ailleurs Expression de protéines NA recombinantes Le gène NA d’un virus de type grippe A / Sydney // HN a été amplifié par PCR avec des amorces contenant les régions non codantes A / WSN / HN NA et le site de restriction SapI, suivi d’une ligature dans le plasmide pPOLI-SapI-Rb vide comme décrit précédemment Le plasmide pPOLI-NAN résultant a été utilisé pour incorporer certaines mutations NA identifiées dans les isolats cliniques du patient en utilisant des amorces appropriées et le site QuickChange. Kit de mutagénèse dirigée Stratagene Pour l’expression de protéines NA recombinantes, des cellules de rein embryonnaire humain T ont été cotransfectées avec μg de chacun des plasmides d’expression pCAGGS-PA, -PB, -PB, un nd-NP de A / WSN / et le plasmide pPOLI-NAN respectif A h après transfection, les cellules ont été traitées avec de l’acide éthylènediaminetétraacétique dans une solution saline tamponnée au phosphate et récoltées. Les cellules ont été remises en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate contenant mmol / 1 de CaCl. à – ° C Les protéines totales des cellules transfectées ont été quantifiées en utilisant le dosage des protéines BCA. Les dosages d’inhibition de Pierce et NA ont été réalisés comme décrit ci-dessus en utilisant une quantité équivalente de protéines exprimées .

Résultats

Caractérisation des isolats de grippe Un total d’échantillons d’aspiration rhinopharyngée et de lavage bronchoalvéolaire ont été récupérés chez un enfant immunodéprimé au cours des mois. Parmi ces échantillons, des isolats de grippe A ont été obtenus par culture cellulaire. Onze isolats cliniques sélectionnés de différentes périodes ont été sous-typés par RT-PCR. / HN et ensuite propagé dans des cellules rénales canines de Madin-Darby avant une table d’analyse phénotypique et génotypique Isolat, qui était une souche de type A / California //, a été récupéré après plusieurs jours de traitement à l’oseltamivir Cet isolat était sensible au médicament dans l’essai d’inhibition NA , avec un IC de nmol / LA isolat de virus ultérieur, qui a été récupéré à partir d’un échantillon de liquide de lavage bronchoalvéolaire après des jours de traitement cumulatif d’oseltamivir, avait un IC d’oseltamivir de nmol / L – plus élevé que le CI de l’isolat mais restait sensible au zanamivir et peramivir L’analyse des séquences de clones d’ADNc des gènes HA et NA de cet isolat a révélé titutions dans le gène NA EG [% des clones], EV [%] et IV [%] et substitutions aa dans le gène HA non trouvé dans les isolats suivants. Le traitement par amantadine a été ajouté à l’oseltamivir après plusieurs jours de traitement en raison de l’excrétion virale persistante. L’analyse séquentielle du gène M a révélé l’émergence de la substitution SN aa après des jours d’isolement de l’amantadine À ce stade, seule la mutation EV NA a été détectée, mais aucun test NAI n’a pu être effectué en raison d’une faible activité enzymatique. Le traitement cumulatif à l’oseltamivir a montré une variation de CI de nmol / L comparativement à celle de WT pour l’oseltamivir, tandis que les valeurs de CI pour le zanamivir et le péramivir ont montré de légères variations par rapport au WT. À ce stade, l’analyse génotypique rétrospective a révélé la présence du Les substitutions NA et IV et l’absence de la mutation EG L’oseltamivir a été remplacé par le nébuliseur en août en raison de l’excrétion virale persistante. Cependant, l’excrétion virale a finalement repris et persisté malgré la réintroduction de l’amantadine et du zanamivir en novembre. Analyse phénotypique de l’isolat clinique de l’isolat de novembre, récupéré quelques jours après l’oseltamivir. l’interruption du traitement, un virus résistant à l’oseltamivir avec IC de nmol / L a été multiplié par une absence de modification significative des susceptibilités au zanamivir et au peramivir Aucune mutation du gène HA n’a été détectée, mais l’analyse du gène NA a révélé une population mixte des mutants du virus WT et EV, ainsi que de nouvelles mutations NA et NK et ST et une délétion de aa La mutation EV n’a pas pu être détectée dans l’isolat et dans les souches virales purifiées sur plaque; la valeur IC de l’oseltamivir de cet isolat était de nmol / L, ce qui n’était que des fois plus élevé que celui de la table des isolats parentaux

Diapositive détailléeDéterminée génotypique et phénotypique d’isolats sélectionnés de l’influenza A prélevés chez un enfant immunocompromisTable View largeTélécharger une analyse génotypique et phénotypique détaillée d’isolats sélectionnés de l’influenza A recueillis chez un enfant immunodéprimé récupéré après des jours de traitement cumulatif au zanamivir et des jours après la cessation de l’oseltamivir une augmentation du CI pour l’oseltamivir nmol / L, une augmentation et une absence de changement significatif pour les autres IAN dans les tests d’inhibition NA. De plus, les tests de sensibilité effectués avec un essai de réduction de la plaque n’ont pas révélé de différence significative entre l’isolat et le zanamivir. respectivement, tandis qu’un isolat EV résistant à l’oseltamivir présentait une augmentation de la valeur de l’IC d’oseltamivir par rapport à l’isolat sensible. De même, l’isolat et le parent n’ont pas élué les globules rouges humains après une nuit d’incubation à ° C en présence ou en abs l’analyse du zanamivir L’analyse de souches virales purifiées sur plaque a révélé les mutations NA suivantes: EV%, IV%, VI% et TI%; aucune de ces substitutions ne faisait partie du site de liaison au récepteur HA, sauf que le SAIsolate, récupéré après des jours de traitement cumulatif au zanamivir, avait un IC de nmol / L multiplié par une augmentation de l’oseltamivir sans modification significative de la sensibilité au zanamivir et peramivir L’analyse génotypique de plaques individuelles sélectionnées au hasard a révélé la présence du% de mutation EV, ainsi que les nouvelles mutations NA YF%, NS% et DN%, alors que de nouvelles substitutions aa ont été trouvées dans la protéine HA. isolat étudié, récupéré après des jours de traitement cumulatif au zanamivir et quelques jours après la fin du traitement par oseltamivir, était désormais sensible à l’oseltamivir IC, nmol / L, ainsi qu’au zanamivir et au péramivir L’analyse génotypique de plaques individuelles choisies au hasard a révélé de nouvelles substitutions NA [% ], NT [%], et SL [%], en plus du changement de DN présent dans l’isolat précédent De note, la mutation EV n’était plus présente Le gène HA contenait de nouvelles substitutions aa non trouvées dans l’isolat précédent Enfin, la mutation M SN associée à la résistance à l’amantadine restait présente plus de jours après l’arrêt du médicamentCaractérisation des protéines mutantes NA recombinantes L’activité NA des protéines mutantes NA recombinantes exprimées dans les cellules T variait La protéine mutante EV était plus résistante à l’oseltamivir que la WT, tandis que les protéines IV et EG présentaient respectivement une augmentation modeste et nulle des valeurs de l’oseltamivir IC, comparées à celles du WT NA. avec le WT intéressant, la présence des substitutions EV et IV avait des effets synergiques sur le phénotype de résistance à l’oseltamivir un changement de CI, tandis que la protéine NA avec les changements EV, IV et EG avaient des valeurs IC d’oseltamivir plus faibles – d’accord avec les profils de sensibilité des isolats et, respectivement

Table View largeTélécharger les données de susceptibilité des protéines recombinantes de la neuraminidase NA testées par des tests d’inhibition de NATable View largeTélécharger des données de sensibilité des protéines recombinantes de la neuraminidase NA testées par des tests d’inhibition de NA

Discussion

Délétions Après un mois de traitement cumulatif à l’oseltamivir, le patient a excrété un virus avec la mutation EV décrite précédemment, qui est la mutation A / HN la plus fréquemment signalée, conférant une résistance à l’oseltamivir. Ce mutant est également sensible au zanamivir et au médicament expérimental. peramivir Fait important, cette mutation du cadre a persisté & gt; mois après l’arrêt du traitement par oseltamivir, indiquant que la mutation NA peut être pathogène et stable en l’absence de pression médicamenteuse chez les sujets immunodéprimés Comme indiqué précédemment , des quasi-espèces de variants résistants et sensibles étaient présentes chez certains patients. Ceci suggère que la présence de populations virales mixtes peut être sous-estimée avec des méthodes de détection réelles basées sur la PCR et le séquençage. Certains isolats résistants à l’oseltamivir contenaient également d’autres isolats résistants à l’oseltamivir. aa Substitutions, telles que EG et IV Résidu n’est pas un cadre ou un résidu catalytique dans la protéine virale et n’est pas connu pour conférer une résistance à l’oseltamivir En revanche, le résidu I est un résidu charpente hautement conservé parmi tous les virus grippaux A et B [ ] La substitution intraveineuse a été rapportée comme contribuant à la résistance à l’oseltamivir dans un virus A / Texas / HN avec la mutation HY Dans cette étude, le seul mutant IV conférait un changement de la sensibilité à l’oseltamivir, tandis que le double mutant IV et HY était associé à une diminution de la sensibilité aux médicaments double. Nos données obtenues avec recombinant protéines mutantes indiquent également un rôle modeste dans la résistance à la mutation IV simple mais un rôle synergique lorsqu’il est associé à la mutation de résistance primaire EV Le changement EG pourrait être une mutation compensatoire, bien que cela doit être formellement prouvé Le rôle d’autres mutations NA inconnues dans certains isolats de nos patients sont actuellement incertains, bien qu’ils ne semblent pas avoir contribué significativement aux phénotypes de résistance aux médicaments en plus de la mutation EV. En raison de la progression des symptômes respiratoires et des résultats de culture virale persistants, le traitement de notre patient a été remplacé. oseltamivir à l’amantadine et au zanamivir Après seulement quelques jours de thérapie à l’amantadine, un virus avec un substituant SN sur dans le gène M a été isolé Cette mutation est la mutation de résistance à l’amantadine plus fréquemment signalée dans les virus de la grippe A / HN [-,] La mutation SN a persisté pour & gt; La mutation SN a été fréquemment rapportée dans des isolats A / HN et A / HN de patients non traités, mettant en évidence la stabilité génétique et la transmissibilité des mutants M Fait intéressant, notre patient a continué à excréter le virus de la grippe tout en traitement par le zanamivir malgré l’absence de virus résistants détectables par des tests d’inhibition NA Il a été montré, cependant, que les mutations HA peuvent conférer une résistance aux INI in vitro , et nous avons effectivement trouvé de nombreuses mutations HA après des mois de zanamivir. ces mutations VI et SA sont proches ou à l’intérieur du site de liaison du récepteur HA, nos mutants HA ne présentaient aucun changement dans la sensibilité au zanamivir quand ils étaient testés par des tests d’élution de plaque ou d’élution de HA. traitement par le zanamivir pourrait s’expliquer par une faible pénétration du médicament dans les voies respiratoires lorsqu’il est nébulisé. , le mode d’administration recommandé du zanamivir par un inhalateur n’était pas possible chez notre jeune patient. Comme notre patient avait été vacciné début novembre, il est également possible que de nouvelles mutations HA soient apparues suite à une pression immunologique suite au développement d’anticorps. Enfin, puisque le dernier isolat récupéré en avril ne contenait pas la mutation EV et présentait un ensemble presque complet de nouvelles mutations NA et HA, il est également possible qu’une certaine recombinaison de virus préexistants ou une nouvelle infection ait eu lieu. Parmi les limites de notre étude, nous notons la sélection potentielle de mutations à la suite de passages in vitro, le manque de fiabilité des tests de réduction de la plaque réalisés avec Madin- Darby cellules rénales canines, et la non-caractérisation des mutations HA En conclusion, notre étude illustre l’évolution moléculaire rapide La persistance à long terme des mutations virales conférant une résistance aux médicaments plusieurs mois après l’arrêt du traitement par l’oseltamivir et l’amantadine et la difficulté rencontrée avec l’administration de zanamivir chez les patients gravement malades renforcent la résistance aux médicaments. la nécessité de développer de nouveaux composés antiviraux et des approches innovantes

Remerciements

Soutien financier Instituts de recherche en santé du Canada à des conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: aucun conflit